国产一区二区精品-国产一区二区精品久-国产一区二区精品久久-国产一区二区精品久久91-免费毛片播放-免费毛片基地

（一）細(xì)胞表面分子交聯(lián)

    交聯(lián)劑常用于鑒定細(xì)胞表面受體和配體。不能通透細(xì)胞膜的水溶性交聯(lián)劑可以交聯(lián)細(xì)胞表面的相互作用蛋白，還可以降低膜的通透性和膜內(nèi)蛋白的反應(yīng)（Ji 197；WedekindF.1989）。

    磺酰基與NHS酯的琥珀酰亞胺酯環(huán)相連就得到了一種水溶性膜不通透的交聯(lián)劑，并且該種交聯(lián)劑不與膜內(nèi)蛋白發(fā)生反應(yīng)。所以，當(dāng)使用硫化NHS酯時(shí)，反應(yīng)時(shí)間和交聯(lián)劑用量都不是很重要的問題。同雙官能團(tuán)、異雙官能團(tuán)NHS酯和光反應(yīng)性芳香疊氮等交聯(lián)劑都是用于交聯(lián)細(xì)胞表面蛋白的合適選擇。

    使用水溶性及水不溶性交聯(lián)劑就可以判斷某一已知蛋白是定位于細(xì)胞膜表面還是定位于膜內(nèi)側(cè)。簡(jiǎn)單說來，該策略的基本原理是，使用交聯(lián)劑處理細(xì)胞后，將交聯(lián)后的細(xì)胞蛋白經(jīng)PAGE膠分離，westernbloting鑒定。如果蛋白位于膜內(nèi)側(cè)，那么只有使用水不溶性交聯(lián)劑才會(huì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。如果蛋白位于細(xì)胞膜外表面，那么不管是使用水溶性還是水不溶性交聯(lián)劑都會(huì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。除了鑒定蛋白定位外，交聯(lián)劑還可以用于膜蛋白的放射性標(biāo)記。BASED是一種同雙官能團(tuán)光反應(yīng)性交聯(lián)劑，常用于蛋白質(zhì)相互作用和結(jié)合的研究中。使用此種交聯(lián)劑就可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞表面蛋白的125I標(biāo)記。

（二）細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)研究

    細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)研究需要具有不同疏水性的試劑以確定細(xì)胞磷脂雙分子層中不同的蛋白、脂質(zhì)和其他分子的定位及其內(nèi)部環(huán)境。熒光標(biāo)簽可以確定細(xì)胞膜內(nèi)外的蛋白、脂質(zhì)和其他分子的定位。具有不同長(zhǎng)度間臂的交聯(lián)劑可以用于交聯(lián)蛋白與相關(guān)分子來確定兩者之間的距離。使用短臂交聯(lián)劑成功交聯(lián)說明兩種分子以某種方式發(fā)生相互作用。如果使用了多種短臂交聯(lián)劑后都不能成功交聯(lián)，則使用長(zhǎng)臂交聯(lián)劑。如果交聯(lián)成功這就說明兩分子可能位于膜內(nèi)的相同空間但是兩者沒有相互作用。同雙官能團(tuán)NHS酯、亞氨酸酯或異雙官能團(tuán)NHS酯/光活丙烯疊氮常由于此類反應(yīng)。雖然亞氨酸酯類交聯(lián)劑是水溶性的，但是它們?nèi)匀豢梢源┩?a href="http://www.hbzhan.com/st164341/list_716926.html">細(xì)胞膜。可與巰基反應(yīng)的交聯(lián)劑也可以用于含有半的蛋白分子與其他分子的交聯(lián)反應(yīng)。

    EDC，水不溶性二環(huán)己基二碳亞胺DCC，和其他的水溶性或是水不溶性交聯(lián)試劑聯(lián)合使用，可以用于研究細(xì)胞膜和分子結(jié)構(gòu)、蛋白亞基結(jié)構(gòu)和排列、酶-底物相互作用和細(xì)胞表面與膜表面受體。相比DCC的高疏水性，EDC的親水性使其更適用于膜和亞基結(jié)構(gòu)研究。通常，的方式是聯(lián)合水溶性和水不溶性交聯(lián)劑以獲得蛋白-蛋白相互作用的完整空間信息。

（三）亞基交聯(lián)和蛋白結(jié)構(gòu)研究

    交聯(lián)劑還可以用于研究蛋白樣品的結(jié)構(gòu)和組成（HeymanandMen-tlein，1980）。某些蛋白比較難以研究是由于它們?cè)诓煌琾H值或鹽濃度條件下存在不同的構(gòu)象。使用交聯(lián)劑交聯(lián)蛋白分子中的亞基即可避免上述蛋白構(gòu)象的改變，便于研究蛋白的結(jié)構(gòu)和亞基組成。一般說來，可與氨基、羧基或是巰基反應(yīng)的交聯(lián)劑都可以用于鑒定蛋白分子的亞基構(gòu)成及其之間的相互作用。并且，上述應(yīng)用中通常選擇短間臂或是中等長(zhǎng)度間臂的交聯(lián)劑。碳二亞酰胺類交聯(lián)劑DFDNB和NHS-ASA是上述研究中常用的分子內(nèi)交聯(lián)劑，它們的合理使用可以避免與外源干擾蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。對(duì)于反應(yīng)條件而言，低濃度的蛋白樣品和高濃度的交聯(lián)劑都有助于保證反應(yīng)的特異性。

（四）蛋白質(zhì)分子之間的交聯(lián)反應(yīng)

    分子生物學(xué)中經(jīng)常需要使用辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶或是某些熒光素分子標(biāo)記的抗體進(jìn)行蛋白檢測(cè)。此外，抗原純化所需的親和介質(zhì)的制備也依賴于ProteinA/G與抗體分子之間的共價(jià)交聯(lián)。所以，交聯(lián)劑在抗體與蛋白分子的交聯(lián)反應(yīng)中有十分廣闊的應(yīng)用。許多交聯(lián)劑都可以用于抗體與蛋白分子之間的交聯(lián)反應(yīng)（Jackson1987）。戊二醛是以前比較常用的交聯(lián)劑，但是交聯(lián)物用于免疫反應(yīng)檢測(cè)時(shí)常出現(xiàn)較高的背景，所以目前較少使用。碳水化合物被氧化后可與伯氨基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，操作簡(jiǎn)便，并且不會(huì)造成免疫檢測(cè)的背景升高，但是會(huì)出現(xiàn)抗體分子的自身交聯(lián)。NHS酯和亞氨酸酯類同雙官能團(tuán)交聯(lián)劑雖然可以用于上述交聯(lián)反應(yīng)，但是也同樣存在聚合和自身交聯(lián)的問題。

    相比之下，異雙官能團(tuán)交聯(lián)劑是用于蛋白質(zhì)分子交聯(lián)的選擇（Nadeau，202）。這是因?yàn)槭褂卯愲p官能團(tuán)交聯(lián)劑可以避免自身交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。目前常用的異雙官能團(tuán)交聯(lián)劑有SMCC和Sulfo-SMCC。交聯(lián)劑DMP和DS可以用于抗體與ProteinA/GSepharose的交聯(lián)。此種方法制備的親和介質(zhì)可以用于純化抗原。抗體的Fc區(qū)可以結(jié)合ProteinA/G，F(xiàn)ab區(qū)可以特異性結(jié)合抗原。DS和DMP可以通過抗體和ProteinA/G的氨基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，從而共價(jià)連接兩種蛋白。

（五）藥物與抗體交聯(lián)

    共價(jià)連接抗腫瘤藥和單克隆抗體可以使藥物導(dǎo)向腫瘤組織，提供腫瘤藥物治療的靶向性（Geofrey190）。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞藥物來說，它們的基團(tuán)需要通過化學(xué)修飾轉(zhuǎn)化為更合適的功能基團(tuán)才能與單抗連接。例如：羥基經(jīng)琥珀酰化很容易轉(zhuǎn)化為羧基，羧酸酯與肼反應(yīng)轉(zhuǎn)為酰肼。

    單抗有一定數(shù)目的反應(yīng)基團(tuán)可用于與藥物交聯(lián)，它們中的一些用于維持抗體三級(jí)結(jié)構(gòu)，使其與抗原結(jié)合。對(duì)單抗廣泛的共價(jià)修飾會(huì)導(dǎo)致抗體可溶性和活性喪失，不同的單抗被修飾的可能程度不同。因此，一旦設(shè)計(jì)了一種合適的交聯(lián)方案，就有必要檢測(cè)抗體活性和蛋白質(zhì)被修飾后的恢復(fù)程度。目前，在單抗分子上引入反應(yīng)基團(tuán)的方法有3種：用異雙功能交叉鏈，碳水化合物經(jīng)高碘酸鈉氧化形成醛基，二硫化物與 DTT反應(yīng)還原形成游離的巰基。

上一篇 抗原的分類 下一篇 細(xì)胞因子引起的病理?yè)p傷