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產(chǎn)品僅供研究使用，不適用于人類或臨床診斷
商品屬性：

產(chǎn)品英文名稱：Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT)

產(chǎn)品中文名稱：末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）

規(guī)格：40 μg/100 μg

貨號：EY-01X8582
用途：僅供科研研究實驗

特點&優(yōu)勢:

序列:氨基酸序列來源于：牛TdT（P06526）（Mer1-Ala509）的氨基酸序列。

蛋白長度：重組牛TdT由509個氨基酸組成，在還原條件下的SDS-PAGE中，它的條帶與理論分子:量一致，為58.3 kDa。

純度:> 90 % ，使用SDS-PAGE檢測

產(chǎn)品形式:蛋白復(fù)溶液，復(fù)溶液為無菌水溶液50 mM K2HPO4, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1% Tween20, 1% BSA, 50% Glycerol, pH 6.5.

基因ID:9913

存儲緩沖液無菌水溶液5動?動

背景

，也稱為末端轉(zhuǎn)移酶，是在未成熟的，B淋巴樣細(xì)胞前提，T淋巴細(xì)胞前體和急性淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤細(xì)胞中表達的一種特殊的DNA聚合酶。 通常，TdT催化將核苷酸添加到DNA分子的3'末端。 與大多數(shù)DNA聚合酶不同，它不需要模板。 該酶的優(yōu)選底物是3'突出端，但它也可以將核苷酸添加到平末端或凹入的3'末端。

本產(chǎn)品具有下列特點:

1.操作簡便、快捷。可直接加入到檢測平板。在96-孔板中檢測時,無需洗滌或收獲細(xì)胞,免去溶解步驟。

2. 無放射性。不需要配制液閃混合物,也不需要處理廢棄物。

3. 與MTT相比,使用更安全。不需要使用揮發(fā)性的有機溶劑來溶解甲臜產(chǎn)物。

4. 操作靈活,與MTT不同,平板讀數(shù)后可放回溫箱繼續(xù)孵育,使顏色進一步生成。

操作步驟：

(一)獲得目的基因

1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板,按基因序列設(shè)計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

(二)構(gòu)建重組表達載體

1、載體酶切:將表達質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切,酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

(三)  獲得含重組表達質(zhì)粒的表達菌種

1、 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,根據(jù)重組載體的標(biāo)志(抗Amp或藍(lán)白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,雙酶切初步鑒定。

2、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆,重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。

3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。

(四)誘導(dǎo)表達

1、挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養(yǎng)。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中, 37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。

3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對照組,余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。

4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min。

5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。

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