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實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細胞簡介：

兔肺大靜脈平滑肌分離自肺大靜脈組織；肺大靜脈在用肺呼吸的脊椎動物中，把動脈血由肺送回心臟的靜脈，是一個靜脈里流動脈血的血管。左右1對，共4條，兩條連接右肺，兩條連接左肺。肺靜脈異位引流是指肺靜脈未能直接與左心房連接，而與右心房或體靜脈系統(tǒng)連接的先天性心血管異位。肺靜脈淤血性肺動脈高壓，是由于肺靜脈內(nèi)血液淤滯而引起的肺動脈高壓。正常情況下，肺循環(huán)具有血壓低、阻力小和順應性大的特點，肺動脈壓力高低取決于單位時間內(nèi)肺動脈血流量和肺血管的阻力，要維持肺循環(huán)的低壓、低阻的狀態(tài)，必須保證整個肺循環(huán)系統(tǒng)的暢通無阻，血液順利地由肺動脈經(jīng)毛細血管進入肺靜脈，再入左心室，經(jīng)過左心室收縮進入體循環(huán)，才能避免肺動脈內(nèi)壓力升高。肺大靜脈平滑肌細胞原代分離培養(yǎng)3天后，可見細胞貼壁伸展，細胞形態(tài)大小不一，呈梭形、不規(guī)則形、三角形或扇形，核卵圓形、居中；2周后細胞匯合，多數(shù)細胞伸展呈長梭形，胞漿豐富，有分枝狀突起，細胞平行排列成單層或部分區(qū)域多層重疊生長，高低起伏；細胞密度低時，常交織成網(wǎng)狀；密度高時，則排列為旋渦狀或柵欄狀。傳代后細胞生長較快，4-6天即可匯合，并保持上述形態(tài)學特征和生長特點。該細胞參與血管壁炎癥反應，保持靜脈管腔的通暢，還是多數(shù)動脈疾病的靶細胞。

方法簡介：

實驗室分離的兔肺大靜脈平滑肌采用-膠原酶聯(lián)合消化法結(jié)合差速貼壁法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

實驗室分離的兔肺大靜脈平滑肌經(jīng)α-SMA免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態(tài)：成纖維細胞樣

傳代特性：可傳5代左右；3代以內(nèi)狀態(tài)佳

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔肺大靜脈平滑肌體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

注意事項：

1. 收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關(guān)信息，如細胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導致細胞出現(xiàn)問題，責任由客戶自行承擔。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表面，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。因運輸問題，部分細胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正常現(xiàn)象。觀察好細胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細胞可以消化，懸浮細胞直接混勻收集細胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

5. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運輸?shù)脑颍瑐€別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細胞僅供科研使用。

8. 備注：運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。收到細胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

大鼠胰島素樣蛋白3(INSL3)檢測試劑盒 ，英文名： INSL3 ELISA Kit

Mouse urokinase type plasminogen activator (uPA) ELISA Kit 小鼠型纖溶酶原激活物(uPA)檢測試劑盒

Mouseansforminggrowthfactorα,TGF-αELISAKit 小鼠轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

CLIAKitforHumanCoisolELISAKit人

細胞BMK激酶活性定量檢測試劑盒(A/B/C)20次

ELISAKitBMP-7大鼠骨成型蛋白7

EGF重組小鼠 EGF / Epidermal Growth Factor 蛋白 (Fc 標簽) Protein

70kDa熱休克蛋白1樣蛋白(HSPA1L)重組蛋白 Recombinant Heat Shock 70kDa Protein 1 Like Protein (HSPA1L)

MKI67重組人 MKI67 蛋白 (GST 標簽) Protein

CLIC4 Protein Human 重組人 CLIC4 蛋白

ACE2 Protein Rat 重組大鼠 ACE2 / Angiotensin-Converting Enzyme 2 蛋白

防御素β113(DEFβ113)重組蛋白 Recombinant Defensin Beta 113 (DEFb113)

CLIC4 Protein Human 重組人 CLIC4 蛋白

SEMA5A重組小鼠 Semaphorin 5A / SEMA5A 蛋白 Protein

FCGRT & B2M Protein Cynomolgus 重組食蟹猴 FCGRT & B2M Heterodimer 蛋白

TSPAN8重組人 TSPAN8 / Tetraspanin 8 / TM4SF3 蛋白 (Fc 標簽) Protein

小鼠鼠痘病毒(MPV)檢測試劑盒 96T/48T

Human gliadin IgA (Gliadin-IgA) ELISA Kit 人麥角蛋白IgA(Gliadin-IgA)檢測試劑盒

HumangelsonELISAKit 人凝膠原蛋白(gelson)檢測試劑盒 96T/48T 進口分裝

Duckviruseeritis,DEV檢測試劑盒鴨病毒性腸病毒(DEV)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

增強型DAB顯色溶液A液：10毫升B液：90毫升C液：1毫升

MousecyclophilinA,CyPAELISAKit小鼠嗜環(huán)蛋白/親環(huán)素A(CyPA)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

兔肺大靜脈平滑肌細胞小鼠神經(jīng)降壓肽（）檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

小鼠神經(jīng)B(NKB)檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

小鼠神經(jīng)A(NKA)檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

小鼠上皮中性粒細胞活化肽78(ENA-78/CXCL5)檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝